पीसीआर के विभिन्न प्रकार: महत्वपूर्ण वैचारिक एमसीक्यू

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विभिन्न प्रकार के पी.सी.आर.

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) मानक पीसीआर प्रक्रिया में मामूली संशोधनों के आधार पर मोटे तौर पर वर्गीकृत किया गया है। पीसीआर के विभिन्न प्रकार इस प्रकार हैं:

नेस्टेड पीसीआर

यह तकनीक यादृच्छिक प्राइमर बाध्यकारी प्रवर्धन के कारण प्रवर्धित डीएनए में संदूषकों को कम करने का प्रस्ताव है। नेस्टेड पीसीआर दो लगातार पीसीआर चक्रों में प्राइमरों के दो अलग-अलग सेटों के साथ किया जाता है। बाद के सेट से प्राथमिक रन के उत्पाद के अंदर माध्यमिक लक्ष्य को बढ़ाना अपेक्षित है। यह तकनीक असाधारण रूप से सफल है, हालांकि इसमें शामिल अनुक्रमों के बहुत अधिक ज्ञान की आवश्यकता है। 

उलटा पीसीआर

यह तब किया जाता है जब टेम्पलेट डीएनए का केवल एकल आंतरिक अनुक्रम ज्ञात होता है। यह तकनीक विभिन्न जीन आवेषणों के समतल दृश्यों की पहचान में उचित है। प्रक्रिया में टेम्पलेट डीएनए के पाचन और आत्म-बंधाव का अनुक्रम शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप अज्ञात अनुक्रम के अंत में ज्ञात अनुक्रमों के साथ डीएनए का हिस्सा होता है।

विभिन्न प्रकार के पी.सी.आर.
(विभिन्न प्रकार के PCR): Taq पोलीमरेज़ की आणविक संरचना का प्रतिनिधित्व https://commons.wikimedia.org/wiki/File:PDB_1ktq_EBI.jpg

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर)

इसका उपयोग आरएनए पुस्तकालयों से ज्ञात अनुक्रमों को बढ़ाने और पहचानने के लिए किया जाता है। नमूने से प्राप्त आरएनए को फिर एंजाइम रिवर्स एंजाइम ट्रांसक्रिपटेस की कार्रवाई द्वारा पूरक डीएनए (सीडीएनए) में परिवर्तित किया जाता है। विशिष्ट पीसीआर ने बाद में प्रदर्शन किया है। आरटी-पीसीआर व्यापक रूप से पहचान और जीन अभिव्यक्ति के निर्धारण में उपयोग किया जाता है।

विभिन्न प्रकार के पी.सी.आर.
(विभिन्न प्रकार के पीसीआर): आरटी-पीसीआर फ्लोरोफोर्स का उपयोग जीन अभिव्यक्ति के स्तरों का पता लगाने के लिए करता है https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Molecular_Beacons.jpg

असममित पीसीआर

यह चुनिंदा रूप से टेम्पलेट डीएनए के एक स्ट्रैंड को दूसरे से अधिक बढ़ाता है। यह संकरण जांच में प्रयोग किया जाता है जिसमें केवल एक स्ट्रैंड को आदर्श माना जाता है। चुने हुए स्ट्रैंड के लिए अतिरिक्त प्राइमरों की उपस्थिति में मानक पीसीआर को आगे बढ़ाकर आगे बढ़ाई जाती है। 

मात्रात्मक पीसीआर (क्यू-पीसीआर)

यह आरएनए, सीडीएनए या टेम्पलेट डीएनए की प्रारंभिक मात्रा को मापने की अप्रत्यक्ष प्रक्रिया है। क्यू-पीसीआर का उपयोग आमतौर पर पीसीआर उत्पाद की मात्रा को जल्दी से निर्धारित करने के लिए किया जाता है। क्यू-पीसीआर का उपयोग डीएनए नमूने के अंदर विशिष्ट अनुक्रमों का पता लगाने के लिए भी किया जाता है।

मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर या आरटीक्यू-पीसीआर)

यह प्रक्रिया प्रवर्धित उत्पादों की वास्तविक समय मात्रा की निगरानी और मापने के लिए फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करती है। यह मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर QPCR के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है।

टचडाउन पीसीआर

यह तकनीक पीसीआर के दो लगातार चक्रों के बीच एनालिंग तापमान को कम करके गैर-विशिष्ट प्राइमर बंधन को कम करती है।

कॉलोनी पीसीआर

क्लोन (एक्स। ई। कोलाई) का विश्लेषण सही बंधाव उत्पादों के लिए किया जाता है। विशिष्ट कॉलोनी को एक बाँझ टूथपिक के माध्यम से चुना जाता है और मास्टर मिश्रण में पेश किया जाता है। पीसीआर को 95 पर विस्तारित समय के साथ संचालित किया जाता हैoC.

एलेले-विशिष्ट पीसीआर

यह तकनीक एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) पर आधारित है, एलील-विशिष्ट पीसीआर अक्सर क्लोनिंग और नैदानिक ​​उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जाता है। एलील के डीएनए अनुक्रम और उनके अंतर के बारे में कुछ पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है। एलील-विशिष्ट पीसीआर में प्राइमर एसएनपी का उपयोग होता है जिसमें 3 PC छोर होते हैं। सफल एलील-विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन और एसएनपी-विशिष्ट प्राइमर्स अनुक्रम में विशेष एसएनपी की उपस्थिति का संकेत देते हैं।

पॉलीमरेज़ साइकलिंग असेंबली (PCA) या असेंबली PCR

मानक पीसीआर प्रक्रिया के बाद लंबे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और शॉर्ट ओवरलैपिंग सेगमेंट की उपस्थिति में लंबे डीएनए अनुक्रमों के कृत्रिम उत्पादन को शामिल करता है। लंबे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स दोनों दिशाओं (अर्थ और एंटी-सेंस) में फ़्लिप करते हैं, ओवरलैपिंग सेगमेंट पीसीआर टुकड़े के क्रम को तय करता है, जिससे अंतिम लंबे डीएनए के चयनात्मक उत्पादन की सुविधा मिलती है।

रैखिक-बाद-घातीय पीसीआर (LATE-PCR)

इस तकनीक में, सीमित प्राइमर (कम मात्रा में मौजूद प्राइमर) में प्रतिक्रिया प्राइमर को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त प्राइमर (पर्याप्त मात्रा में प्राइमर) की तुलना में अधिक गलनांक होता है क्योंकि लिमिनेटर प्राइमर की एकाग्रता प्रतिक्रिया के बीच में कम हो जाती है। । 

डायल-आउट पीसीआर

यह जीन संश्लेषण के लिए डीएनए अणुओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए एक विधि है। डीएनए का एक पुस्तकालय अनुक्रमण से पहले विशिष्ट फ़्लैंकिंग टैग के साथ संशोधित किया गया है। बाद में, टैग निर्देशित प्राइमर पीसीआर द्वारा वांछित अनुक्रमों के डीएनए की वसूली की अनुमति देते हैं।

हेलिकेज़-आश्रित प्रवर्धन

यह पारंपरिक पीसीआर से संबंधित है, लेकिन यह साइकिल चलाने के बजाय लगातार तापमान का उपयोग करता है। थर्मल अपघटन चरण के बजाय डीएनए हेलिकेज़ का उपयोग किया जाता है। 

हॉट स्टार्ट पीसीआर

इस तकनीक ने पीसीआर के प्रारंभिक चक्रों के दौरान गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की संभावना को रोक दिया। प्रतिक्रिया अवयवों को विकृतीकरण तापमान पर गर्म किया जाता है जो कि 95 होता हैoपोलीमरेज़ जोड़ने से पहले सी। अवरोध करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में अवरोधक और एंटीबॉडी पेश किए जाते हैं डीएनए बहुलक गतिविधि, जो उच्च तापमान पर अलग हो जाती है। 

अंतर-अनुक्रम विशिष्ट पीसीआर

पीसीआर तकनीक के इस संशोधन का उपयोग अक्सर डीएनए फिंगरप्रिंटिंग के लिए किया जाता है, जिसके लिए एक विशिष्ट और विशिष्ट फिंगरप्रिंट / पैटर्न प्रवर्धित डीएनए टुकड़े उत्पन्न करने के लिए सरल अनुक्रमों के बीच रखे गए क्षेत्रों के प्रवर्धन की आवश्यकता होती है। 

बंधाव मध्यस्थता पीसीआर

यह विशेष रूप से डीएनए के छोटे लिंकर अणुओं (सम्मिलित होने के लिए) और लिंकर डीएनए के साथ एनेलिंग करने में सक्षम विभिन्न प्राइमरों का उपयोग करता है। इस तकनीक का बड़े पैमाने पर डीएनए अनुक्रमण और फुट-प्रिंटिंग के लिए उपयोग किया जाता है।

मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर

इस तकनीक का उपयोग जीनोम में CpG द्वीपों का पता लगाने के लिए किया जाता है। मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर में, डीएनए का इलाज सोडियम बाइसल्फेट के साथ किया जाता है, जो अनमेथिलेटेड साइटोसिन बेस को यूरैसिल में परिवर्तित करता है, जिसे पीसीआर प्राइमर थाइमिन बेस से पहचाना / पहचाना जाता है। प्राइमर CpG द्वीपों को छोड़कर समान प्राइमर सेटों का उपयोग करके परिवर्तित डीएनए पर दो अलग पीसीआर सेट किए जाते हैं। प्राइमर सेट साइटोसिन बेस को पहचानते हैं और प्राइमर के अन्य सेट यूरैसिल को अनमेथिलेटेड डीएनए को बढ़ाने के लिए पहचानते हैं। क्यू-पीसीआर को मेथिलिकरण के बारे में मात्रात्मक जानकारी जानने के लिए भी किया जा सकता है। 

विभिन्न प्रकार के पीसीआर पर संकल्पित MCQs (हल)

प्रश्न 1: एक शोधकर्ता एक पीसीआर प्रवर्धित डीएनए अंशों के बीच में क्रमिक आधार जोड़े को बदलने की कोशिश कर रहा है। इस तरह के प्रयोग को करने के लिए किस तकनीक की सबसे ज्यादा सिफारिश की जाती है?

उ०— डीएनए लेजियम

बी- इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता शिफ्ट परख (EMSA)

सी- पीसीआर उत्परिवर्तन

D- प्रतिबंध वाले एंजाइम पाचन

सही जवाब: विकल्प सी पीसीआर उत्परिवर्तन 

स्पष्टीकरण:

इस तरह के संशोधनों के लिए सबसे अनुशंसित तकनीक पीसीआर उत्परिवर्तन है। यह उन प्राइमरों को संश्लेषित कर सकता है जो पारस्परिक रूप से उत्परिवर्तजन के वांछित स्थान पर बांधते हैं। इन प्राइमरों में अब नए डीएनए स्ट्रैंड में पेश किए जाने वाले नए 5-बेस पेयर सीक्वेंस होंगे। सबसे पहले, पीसीआर उत्परिवर्ती अनुक्रम और अपस्ट्रीम अनुक्रम वाले डीएनए टुकड़े को बढ़ाएगा। पीसीआर का दूसरा चक्र उत्परिवर्ती अनुक्रमों और डाउनस्ट्रीम अनुक्रमों वाले नए डीएनए स्ट्रैंड को बढ़ाएगा। और पीसीआर के अंतिम चक्र में दो टेम्प्लेट में से एक डीएनए टुकड़ा बढ़ेगा, मूल प्राइमरों का उपयोग करके पूर्ण लंबाई वाले डीएनए स्ट्रैंड को बढ़ाना होगा।

प्रश्न 2: पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) डीएनए स्ट्रैंड को बढ़ाने के लिए एक हीट-स्टेबल पोलीमरेज़ (टाक पोलीमरेज़) का उपयोग करता है। बयान में से कौन सा सबसे अच्छा वर्णन करता है कि पीसीआर के लिए थर्मो-स्थिर पॉलिमरेज़ क्यों आवश्यक हैं?

A- पीसीआर को थर्मल साइकलिंग की जरूरत होती है, और टैक पोलीमरेज़ को निष्क्रिय किया जा सकता है क्योंकि कम तापमान वाले चरणों के दौरान इनकी आवश्यकता नहीं होती है। 

B- ताप स्थिर (Taq) पोलीमरेज़ dsDNA को तब तक नहीं तोड़ता जब तक कि तापमान बहुत अधिक न हो। इसलिए एक गर्मी-स्थिर (Taq) पोलीमरेज़ की आवश्यकता होती है।

सी- पीसीआर को थर्मल साइकलिंग की जरूरत होती है, और उच्च तापमान (95) के दौरान डीएनए पोलीमराइजेशन में प्रभावकारिता खोने के लिए हीट-स्टेबल (टैक) पॉलीमरेज को अस्वीकार नहीं किया जाएगा।oसी) कदम। 

डी- उच्च तापमान वाले चरणों के दौरान शिष्टाचार और डीएनए पोलीमरेज़ के बीच की बातचीत बहुत कुशल है। इस प्रकार पीसीआर को गर्मी-स्थिर डीएनए पोलीमरेज़ की आवश्यकता होती है।

ई- हीट स्थिर (Taq) पोलीमरेज़ मानक पोलीमरेज़ की तुलना में सस्ते हैं; इस प्रकार, वे डीएनए को बढ़ाने के लिए अधिक उपयुक्त हैं। 

सही उत्तर: विकल्प C

पीसीआर को थर्मल साइकलिंग की आवश्यकता होती है, और उच्च तापमान (95) के दौरान डीएनए पोलीमराइजेशन में प्रभावकारिता खोने के लिए हीट-स्टेबल (टैक) पॉलीमरेज़ से इनकार नहीं किया जाएगा।oसी) कदम। यह विभिन्न प्रकार के पीसीआर के बीच अद्वितीय बनाता है।

स्पष्टीकरण:

पॉलीमरेज़ अक्सर उच्च तापमान पर इनकार करते हैं। यदि एक मानक पोलीमरेज़ का उपयोग किया गया था, तो यह उच्च तापमान (विकृतीकरण) चरण के दौरान विकृत हो जाएगा, जो कि डबल-फंसे डीएनए को एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट्स में तोड़ने के लिए आवश्यक है। इस ऊष्मा-स्थिर (Taq) पोलीमरेज़ का उपयोग करके, एंजाइम इनकार नहीं करेगा. पीसीआर की शुरुआत में जोड़े गए टाक पोलीमरेज़ द्वारा डीएनए स्ट्रैंड को बढ़ाना जारी रहेगा।

प्रश्न 3: पीसीआर के तीन चरणों का सही क्रम क्या है?

उ०— विस्तार, विकृतीकरण, एनीलिंग

बी- डेनेचरेशन, एनीलिंग, एक्सटेंशन 

सी- एनीलिंग, विस्तार, विकृतीकरण

डी- डेनेचरेशन, एक्सटेंशन, एनीलिंग

सही उत्तर: विकल्प बी

विमुद्रीकरण, एनीलिंग, विस्तार 

स्पष्टीकरण:

पीसीआर के चरणों में विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार शामिल हैं।

दोहरे-फंसे डीएनए के हाइड्रोजन बांड को तोड़ने के लिए 94-98 डिग्री सेल्सियस के आसपास के तापमान पर विकृतीकरण किया जाता है। 

एनीलिंग 50-65 डिग्री सेल्सियस पर पूरा किया गया पीसीआर का दूसरा चरण है। एकल स्ट्रैंड के लिए प्राइमरों के लगाव के लिए एनेलिंग चरण को कम तापमान पर किया जाना चाहिए, लेकिन अनिर्दिष्ट संकरण से बचने के लिए पर्याप्त उच्च। 

पीसीआर का विस्तार या बढ़ाव कदम डीएनए पोलीमरेज़ को टेम्पलेट डीएनए स्ट्रैंड की नवीनतम प्रतिलिपि को संश्लेषित करने की अनुमति देता है। इष्टतम तापमान का उपयोग डीएनए पोलीमरेज़ पर निर्भर करता है, लेकिन आमतौर पर 75-80 डिग्री सेल्सियस तक होता है।

प्रश्न 4: निम्नलिखित में से कौन एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन मिश्रण का घटक नहीं है?

उ०— बफर हल

बी- डीएनए पोलीमरेज़

सी- फॉर्मामाइड

डी- डीएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड

सही उत्तर: विकल्प C

formamide

स्पष्टीकरण:

पीसीआर की सामग्री डीएनए (टैक) पोलीमरेज़, बफर, प्राइमर, मैग्नीशियम क्लोराइड, डीएनटीपी (एडेनिन, ग्वानिन, साइटोसिन, थाइमिन), डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट और डीएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड हैं।

निष्कर्ष

इस लेख में हमने विभिन्न प्रकार के पीसीआर पर चर्चा की है। इस विषय पर अधिक जानकारी के लिए देखें विभिन्न प्रकार के पी.सी.आर..

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