पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन: 9 महत्वपूर्ण स्पष्टीकरण

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विषय-सूची

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन क्या है?

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक और व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है आणविक जीव विज्ञान सेलुलर मशीनरी का उपयोग किए बिना डीएनए के उत्पादन के लिए रासायनिक रूप से तकनीक, उदाहरण के लिए, खमीर या ई। कोलाई। विधि सीमित मात्रा में अनुमति देती है डीएनए करने के लिए हो सकता है प्रवर्धित कई गुना नाटकीय रूप से। पीसीआर में नियमित रूप से उपयोग किया जाता है नैदानिक, फोरेंसिक, और विभिन्न उद्देश्यों के लिए जैविक प्रयोगशालाएं, जैसे कि निर्धारण आनुवंशिक उंगलियों के निशान, रोग का निदान, जीन क्लोनिंग, और पितृत्व परीक्षण. 

यह तकनीक 1983 में Kary Mullis द्वारा बनाई गई थी। पीसीआर वर्तमान में एक महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जिसका उपयोग लागू जीव विज्ञान में किया जाता है। ये सम्मिलित हैं डीएनए क्लोनिंग अनुक्रमण के लिए, डीएनए-आधारित फ़्लोजेनी, या जीन अभिव्यक्ति की सक्रिय जांच और आनुवंशिक रूप से संचरित रोगों का निर्धारण। 1993 में, मुलिस को पीसीआर में अपने काम के लिए रसायन विज्ञान के नोबेल पुरस्कार के साथ प्रदान किया गया। 

पीसीआर को आमतौर पर एक इंस्ट्रूमेंट में 0.1-0.2 मिलीलीटर की कुल मात्रा के रिएक्शन मिश्रण (0.2-0.5 मिली लीटर) में ले जाया जाता है। एक थर्मल साइक्लर। एक थर्मल साइक्लर डीएनए को गर्म करता है और प्रतिक्रिया के प्रत्येक चरण में आवश्यक तापमान तक पहुंचने के लिए डीएनए को ठंडा करता है। पतली दीवार वाली प्रतिक्रिया नलिकाएं वांछित तापीय चालकता प्रदान करती हैं जिससे तेज थर्मल संतुलन की अनुमति मिलती है। आमतौर पर, थर्मल साइक्लर्स ने सबसे ऊपर या ढक्कन को गर्म किया है जो ट्यूब के शीर्ष पर प्रतिक्रिया घटकों के संघनन को रोकता है। 

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
चित्रा: थर्मल साइक्लर
https://www.flickr.com/photos/45141485@N04/6358197387/

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन की आवश्यकताएं

  • डीएनए प्रवर्धित होना (टेम्पलेट डीएनए या सीडीएनए)
  • प्राइमरों (आगे प्राइमर और रिवर्स प्राइमर) टेम्पलेट डीएनए के सिरों को पहचानने में सक्षम। प्राइमर आमतौर पर 18-25 बेस जोड़े लंबे होते हैं।
  • थर्मो-स्थिर डीएनए बहुलक (टाक पॉलिमरेज़) डीएनए संश्लेषण को उत्प्रेरित करता है। टाक पोलीमरेज़ से प्राप्त किया जाता है थर्मस जलीय।
  • न्यूक्लियोटाइड
  • बफर (थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि के लिए एक इष्टतम माध्यम प्रदान करता है)
डीएनए
चित्रा: डीएनए पीसीआर के माध्यम से प्रवर्धित किया जाता है
https://www.flickr.com/photos/hinkelstone/33255693331/

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन का कार्य सिद्धांत

पीसीआर को एक चेन रिएक्शन कहा जाता है क्योंकि नए संश्लेषित स्ट्रैंड्स बाद के चक्रों में डीएनए के आगे संश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करेंगे। 

पीसीआर में 3 क्रमिक प्रतिक्रियाएं होती हैं:

  • डीएनए का विकृतीकरण: विकृतीकरण की प्रक्रिया डबल स्ट्रैंडेड डीएनए के स्ट्रैंड्स को अलग करती है। मानव डीएनए के लिए, विकृतीकरण तापमान लगभग 93-95oC है। डीएनए के दो पोलीन्यूक्लियोटाइड स्ट्रैंड के बीच हाइड्रोजन बांड को तोड़कर डीएनए का विकृतीकरण किया जाता है। विकृतीकरण प्रक्रिया अक्सर 5 मिनट या विस्तारित समय के लिए की जाती है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि टेम्प्लेट डीएनए के दोनों स्ट्रैंड एक दूसरे से पूरी तरह से अलग हैं। विकृतीकरण प्रक्रिया थर्मो-स्थिर डीएनए पोलीमरेज़ को भी सक्रिय करती है।
  • प्राइमर की घोषणा: विकृतीकरण के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण में आगे और पीछे प्राइमरों को पेश किया जाता है। फिर प्राइमर एनीलिंग के लिए समाधान को ठंडा किया जाता है। आमतौर पर, प्राइमर एनीलिंग 50-70 के बीच होता हैoC डीएनए के Tm (पिघलते हुए तापमान) पर निर्भर करता है। आदर्श रूप से, annealing तापमान 5 हैoTm के नीचे C। प्राइमर और टेम्पलेट डीएनए के बीच हाइब्रिड बनाने के लिए एनीलिंग तापमान कम होना चाहिए और बेमेल संकरों को रोकने के लिए पर्याप्त उच्च होना चाहिए। डीएनए का टीएम केवल डीएनए के जीसी और एटी सामग्री पर निर्भर करता है। प्राइमर एनीलिंग कदम में आमतौर पर 1-2 मिनट लगते हैं। टीएम को प्रायोगिक रूप से निर्धारित किया जा सकता है या सैद्धांतिक रूप से गणना निम्न सूत्र द्वारा की जा सकती है:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]oC

  • डीएनए संश्लेषण: थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ (टाक पोलीमरेज़) के पास बांधता है आरएनए बाध्यकारी क्षेत्र और मुक्त न्यूक्लियोटाइड को शामिल करता है टेम्प्लेट स्ट्रैंड से सटे डीएनए के एक नए स्ट्रैंड को बढ़ाना और संश्लेषित करना। विस्तार चरण का इष्टतम तापमान उपयोग किए गए पोलीमरेज़ के प्रकार पर निर्भर करता है; टाक पोलीमरेज़ के लिए, इष्टतम तापमान लगभग 72 . हैoC. यह विस्तार चरण की अवधि टेम्पलेट डीएनए की लंबाई और थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ की दक्षता पर निर्भर करती है; आमतौर पर, यह प्रति मिनट एक किलोबा जोड़े है।

ऊपर उल्लिखित सभी प्रतिक्रियाओं को 30 बार दोहराया जाता है ताकि टेम्पलेट डीएनए की लगभग 1 बिलियन प्रतियां प्राप्त हो सकें।

पीसीआर WP अद्यतन 3
चित्रा: पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा डीएनए प्रवर्धन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व
https://www.flickr.com/photos/genomegov/26454931973/

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन के चरण

पीसीआर की प्रक्रिया को तीन चरणों में विभाजित किया गया है:

  • घातीय प्रवर्धन: डीएनए पोलीमरेज़ इष्टतम कार्य करता है, और हर चक्र के पूरा होने के बाद, उत्पाद की मात्रा दोगुनी हो जाती है। प्रतिक्रिया के बहुत संवेदनशील होने के बाद ही डीएनए की थोड़ी मात्रा को प्रतिक्रिया के प्रारंभिक बिंदु पर मौजूद होना चाहिए।
  • लेवलिंग-ऑफ स्टेज: डीएनए पोलीमरेज़ न्यूक्लियोटाइड्स जैसे अभिकर्मकों की कम उपलब्धता के कारण कम गतिविधि को दर्शाता है।
  • पठार: अभिकर्मक की थकावट के कारण कोई और उत्पाद नहीं बनता है।

पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन का उपयोग

पीसीआर का उपयोग कई जीनोम से जुड़ी असामान्यताओं, विश्लेषणों की एक विस्तृत श्रृंखला और प्रयोगों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। पीसीआर के उपयोग के कुछ उदाहरण नीचे दिए गए हैं:

  • नमूने में संक्रामक एजेंटों जैसे सीएमवी, माइकोप्लाज्मा, निमोनिया, संक्रामक और प्रोटोजोआ संबंधी बीमारियों, हेपेटाइटिस आदि की पहचान।
  • ख़राबी का निर्धारण, विशेष रूप से लिंफोमा और ल्यूकेमिया के मामले में। 
  • पितृत्व परीक्षण और आनुवंशिक फिंगरप्रिंटिंग। 

पीसीआर असामान्यताओं की शीघ्र पहचान की अनुमति देता है जो वर्तमान में कैंसर अनुसंधान में सबसे अधिक विकसित हैं। किसी अन्य विधि की तुलना में 10,000 गुना से अधिक की संवेदनशीलता के साथ स्थानान्तरण विशिष्ट घातक कोशिकाओं को पहचानने के लिए पीसीआर उपायों को सीधे जीनोमिक डीएनए नमूनों पर किया जा सकता है। 

पीसीआर टिशू कल्चर तकनीक और पशु आधारित मॉडल से गैर-खेती योग्य और धीमी गति से बढ़ने वाले सूक्ष्मजीवों, जैसे कि माइकोबैक्टीरिया, एनारोबिक सूक्ष्मजीव और वायरस की पहचान करता है। माइक्रोबायोलॉजी में पीसीआर प्रदर्शनकारी रोगजनकों की पहचान और करने की क्षमता है रोगजनक उपभेदों से गैर-रोगजनक के बीच अंतर विशिष्ट जीन की पहचान करके। 

पीसीआर का उपयोग डीएनए स्ट्रैंड के एक छोटे टुकड़े को तेज करने के लिए किया जाता है। यह डीएनए स्ट्रैंड एक पूर्ण जीन या जीन का एक हिस्सा मात्र हो सकता है। जीवित प्रणालियों के विपरीत, पीसीआर चक्र केवल छोटे डीएनए अंशों को बढ़ा सकता है 10 किलोबाईस जोड़े तक. कई अन्य तकनीकें डीएनए के टुकड़ों को आकार में 40 kb तक बढ़ा सकती हैं, जो अभी भी के आकार से कम है एक यूकेरियोटिक का गुणसूत्र डीएनए कोशिका - उदाहरण के लिए, एक मानव कोशिका में लगभग तीन अरब न्यूक्लियोटाइड आधार जोड़े होते हैं। 

पैतृक परीक्षण विवाद वाले व्यक्तियों का डीएनए लेकर पीसीआर का उपयोग कर किया जा सकता है। परीक्षण व्यक्तियों के डीएनए को बढ़ाया और पचाया जाता है प्रतिबंधित एंजाइम और जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ विश्लेषण किया। एग्रोस जेल पर डीएनए के टुकड़ों के पैटर्न को व्यक्ति के डीएनए फिंगरप्रिंट के रूप में जाना जाता है। निकट या रक्त से संबंधित व्यक्तियों के पास समान होगा डी ऑक्सी राइबो न्यूक्लिक एसिड अंगुली का निशान दूर से संबंधित या असंबंधित व्यक्तियों की तुलना में पैटर्न। दो या अधिक आनुवंशिक (डीएनए) उंगलियों के निशान वाले माता-पिता-बच्चे या भाई-बहनों के लिए प्राप्त उंगलियों के निशान का और विश्लेषण किया जा सकता है। प्राप्त डीएनए फिंगरप्रिंट का उपयोग जानने के लिए किया जा सकता है जीवों के बीच विकासवादी संबंध। 

इसका आकार पीसीआर के अंतिम उत्पाद को आसानी से पहचान सकता है agarose gel वैद्युतकणसंचलन। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन agarose जेल में डीएनए नमूने इंजेक्ट करके किया जाता है। डीएनए सैंपल की गतिशीलता को जानने के लिए इलेक्ट्रिक करंट को agarose gel से गुजारा जाता है। छोटे डीएनए टुकड़े जेल और इसके विपरीत तेजी से चलते हैं। पीसीआर उत्पाद और नमूना डीएनए टुकड़ा agarose जेल में एक डीएनए सीढ़ी शुरू करने से पहचाने जाते हैं। डीएनए सीढ़ी में ज्ञात आकार के डीएनए अणु होते हैं। 

पहले, जीनोम को देखकर आनुवंशिक विकार की पहचान करना एक कठिन काम था। बाद में पीसीआर के विकास से इस प्रक्रिया को छोटा कर दिया जाता है। रुचि के किसी भी जीन को उपयुक्त प्राइमरों का उपयोग करके आसानी से बढ़ाया जा सकता है और फिर डीएनए में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुक्रमित किया जा सकता है। कुछ घातक वायरल संक्रमणों की शीघ्र पहचान पीसीआर के माध्यम से भी की जा सकती है। 

डीएनए उंगली
चित्रा: डीएनए फ़िंगरप्रिंटिंग का उपयोग पैतृक परीक्षण के लिए किया जाता है
https://www.flickr.com/photos/nasamarshall/33350284091/

पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन के प्रकार

तकनीक में कुछ उपयुक्त संशोधनों के आधार पर, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन निम्न प्रकारों में वर्गीकृत किया गया है:

  • नेस्टेड पीसीआर
  • उलटा पीसीआर
  • रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (RT-PCR)
  • असममित पीसीआर
  • मात्रात्मक (पीसीआर-क्यू-पीसीआर)
  • मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (QRT-PCR)
  • टचडाउन पीसीआर
  • कॉलोनी पीसीआर
  • एलील-विशिष्ट पीसीआर
  • असेंबली पीसीआर या पॉलीमरेज़ साइकलिंग असेंबली (PCA)
  • असममित पीसीआर
  • घातीय-पीसीआर (लेट-पीसीआर) के बाद रैखिक
  • डायल-आउट पीसीआर
  • हेलिकेज़-आश्रित प्रवर्धन
  • हॉट स्टार्ट पीसीआर
  • अंतर-अनुक्रम विशिष्ट पीसीआर
  • उलटा पीसीआर
  • बंधाव मध्यस्थता पीसीआर
  • मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर
  • मिनी-प्राइमर पीसीआर

पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन के फायदे

  • पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन का उपयोग विभिन्न आनुवंशिक असामान्यताओं की पहचान के लिए किया जा सकता है।
  • पीसीआर का उपयोग आणविक जीव विज्ञान में प्रयोगशाला प्रयोगों और प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में किया जाता है।
  • पीसीआर पता लगा सकता है- ल्यूकेमिया, लिम्फोमा, आदि जैसी घातक बीमारियां, और विभिन्न अन्य स्थितियां जैसे टोक्सोप्लाज्मा गोंडी, स्टैफिलोकोकल बैक्टरेरिया, मलेरिया संक्रमण आदि।
  • जेनेटिक फ़िंगरप्रिंटिंग और पितृत्व परीक्षण में पीसीआर उनके महत्वपूर्ण कदम के रूप में शामिल है।
  • पीसीआर की उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता इसे जैव प्रौद्योगिकी और आणविक जीव विज्ञान आधारित प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाती है।

पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन के नुकसान

  • पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन के लिए थर्मल साइक्लर, डीएनए इलेक्ट्रोफोरमैटिक असेंबली, डीएनए आइसोलेशन किट और अन्य महंगे रसायनों की आवश्यकता होती है, जो इस प्रक्रिया को महंगा बनाते हैं।
  • प्रयोगों के संचालन के लिए प्रशिक्षित, योग्य और अनुभवी तकनीशियनों की आवश्यकता होती है।
  • डी-ह्यूमिडिफ़ायर और लामिना के प्रवाह सुविधाओं के साथ बुनियादी सुरक्षा स्तर की प्रयोगशालाओं की आवश्यकता होती है।
  • नियमित जनता के लिए पीसीआर-आधारित परीक्षण को वहन करना कठिन है।
  • पीसीआर के माध्यम से सभी बीमारियों की पहचान और निदान नहीं किया जा सकता है।
  • झूठे-सकारात्मक और झूठे-नकारात्मक परिणाम प्राप्त करने की संभावना।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ कई घातक संक्रामक एजेंटों की पहचान के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली और व्यापक रूप से स्वीकृत तकनीक है। पीसीआर का उपयोग विभिन्न उन्नत सुविधा चिकित्सा केंद्रों, आधुनिक प्रयोगशालाओं और चिकित्सा संस्थानों में नियमित निदान और अनुसंधान मॉड्यूल के रूप में किया जा रहा है। पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन असामान्य नैदानिक ​​​​लक्षणों का प्रतिनिधित्व करने वाली असामान्यताओं की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; पीसीआर इस प्रकार की दुर्बलताओं का शीघ्र पता लगाने में सक्षम बनाता है। जल्दी पता लगाने से व्यक्ति को बेहतर तरीके से प्रबंधित करने में मदद मिल सकती है, जिससे विषय के परिवार पर सामाजिक और आर्थिक बोझ कम हो सकता है।

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अवधारणा चेकर MCQs

प्रश्न सं। 1: एक छात्र टेम्पलेट डीएनए के एक नमूने को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्रदर्शन कर रहा है। लेकिन, वह प्रयोग में डीएनए प्राइमर जोड़ना भूल गया। निम्न में से कौन सा विकल्प सर्वोत्तम संभावित परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है?

A- प्रतिक्रिया नहीं होगी।

बी- रिएक्शन काम करेगा, लेकिन यह प्रक्रिया गैर-विशिष्ट क्षेत्रों को बढ़ाएगी (डीएनए के वांछित डीएनए भाग को नहीं।

C- रिएक्शन काम करेगा लेकिन लंबे समय तक

डी- रिएक्शन काम करेगा, और उत्पाद अवांछित म्यूटेशन दिखाएगा।

विकल्प ए: "प्रतिक्रिया नहीं होगी" सही उत्तर है।

स्पष्टीकरण: पीसीआर के कामकाज के लिए प्राइमर जरूरी हैं। टाक पोलीमरेज़ को आरंभ करने के लिए बाध्यकारी (एनीलिंग चरण में) की आवश्यकता होती है डी एन ए की नकल. इस प्रकार पीसीआर प्राइमरों की अनुपस्थिति में काम नहीं करेगा, और कोई प्रवर्धन नहीं होगा।

प्रश्न सं। 2: एक छात्र / शोधकर्ता परिणामी फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए माउस कोशिकाओं में जीन को अभिव्यक्त करने के लिए मानव हीमोग्लोबिन जीन को सम्मिलित करना चाहता है। निम्नलिखित में से कौन सी प्रक्रिया छात्रों / शोधकर्ता को जीन को सफलतापूर्वक क्लोन करने की अनुमति देगी?

विकल्प ए:

1. पीसीआर के माध्यम से जीन को प्रवर्धित करें

2. अभिव्यक्ति वेक्टर को काटने के लिए प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करें

3. Ligate जीन और पचा हुआ सदिश

विकल्प बी: 

1. जीन जीन

2. अभिव्यक्ति वेक्टर को काटने के लिए प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करें 

3. पीसीआर के माध्यम से जीन और पचा अभिव्यक्ति वेक्टर बढ़ाना

विकल्प सी:

1. अभिव्यक्ति वेक्टर को काटने के लिए प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करें

2. पीसीआर के माध्यम से जीन को प्रवर्धित करें

3. Ligate जीन और पचा हुआ सदिश

विकल्प D:

1. अभिव्यक्ति वेक्टर को काटने के लिए प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करें

2. Ligate जीन और पचा हुआ सदिश

3. पीसीआर के माध्यम से जीन को प्रवर्धित करें

विकल्प ए: है सही विकल्प 

1. पीसीआर के माध्यम से जीन को प्रवर्धित करें

2. अभिव्यक्ति वेक्टर को काटने के लिए प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करें

3. Ligate जीन और पचा हुआ सदिश

व्याख्या: सबसे पहले, हम मानव जीनोम से ब्याज के जीन को बढ़ाने के लिए पीसीआर का उपयोग करेंगे, जिसके सिरे पर प्रतिबंध स्थल होंगे (इससे प्रतिबंध के बंधन में मदद मिलेगी) एंजाइम पचा वेक्टर)। बाद में, एक ही प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके अभिव्यक्ति वेक्टर को पचाने की आवश्यकता होती है, और फिर पचने वाले वेक्टर और प्रवर्धित जीन को एक साथ जोड़ा जाता है। अंतिम उत्पाद में दो खंड होंगे: मूल वेक्टर और रुचि का जीन।

प्रश्न सं। 3: पीसीआर के माध्यम से डीएनए प्रवर्धन को पूरा करने के लिए किस उपकरण का उपयोग किया जाता है?

A- जेनेटिक विश्लेषक

बी- यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर

सी- थर्मोसायकलर

D- सेंट्रीफ्यूज

विकल्प सी: थर्मोसायक्लर इसका सही उत्तर है

स्पष्टीकरण: थर्मो-साइक्लर को रिएक्शन वॉल्यूम की एक छोटी मात्रा में क्रमशः, विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार चरणों के एक चक्र को संचालित करने के लिए सेट किया जा सकता है। एक थर्मल साइक्लर का उपयोग पीसीआर प्रवर्धन करने के लिए किया जाता है।

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